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根瘤菌肥料

Rhizobium fertilizer



    2000-12-22發布 2001-04-01實施

中華人民共和國農業部發布



前言

本標準在原有標準 NY227-1994《微生物肥料》的基礎上，對其中的根瘤菌肥料部分進行修改。

主要修改內容如下：

—增加定義、抽樣和判定規則部分；

—增加菌種部分，包括菌種有效性、菌體特性特征、菌落形態；

—刪除成品無害化指標。因為根瘤菌肥料一般以草炭為載體，而且每公頃每年僅用750 ~ 7500g根瘤菌肥拌種，不存在重金屬的危害。草炭經高溫滅菌后，大腸桿菌和蛔蟲卵不再存活。

本標準自實施之日起，同時代替 NY227-1994中的根瘤菌肥料部分。

本標準的附錄 A為標準的附錄。

本標準由中華人民共和國農業部提出。

本標準起草單位：農業部微生物肥料質量監督檢驗測試中心、中國農業科學院土壤肥料研究所。

本標準主要起草人：寧國贊、劉惠琴、馬曉彤、葛誠、李俊。



           根瘤菌肥料

Rhizobium fertilizer

1 范圍

本標準規定了豆科根瘤菌肥料的分類、技術要求、檢驗方法、檢驗規則、標志、包裝、運輸及貯存。

本標準適用于以共生固氮性能優良的根瘤菌菌株為生產用菌，經液體發酵生產而成的根瘤菌液體肥料，菌液以持水性能良好的載體為吸附劑制成的根瘤菌固體肥料；也適用于以根瘤菌為主的含有能促進結瘤、固氮作用的芽胞桿菌、假單胞菌或其他有益的促生細菌制成的復合根瘤菌肥料。

2 引用標準

下列標準所包含的條文，通過在本標準中引用而構成為本標準的條文。本標準出版時，所示版本均有效。所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標準最新版本的可能性。

GB/T 6543一1986 瓦楞紙箱

NY 411一2000 固氮菌肥料

3 定義

本標準采用下列定義：

3.1 根瘤菌肥料

用于豆科作物接種，使豆科作物結瘤、固氮的接種劑。

3.2復合根瘤菌肥料

以根瘤菌為主，加入少量能促進結瘤、固氮作用的芽胞桿菌、假單胞細菌或其他有益的促生微生物的根瘤菌肥料，稱為復合根瘤菌肥料。加入的促生微生物必須是對人畜及植物無害的菌種。

4 產品分類

4.1 按形態不同，分為液體根瘤菌肥料和固體根瘤菌肥料。

4.2 以寄主種類的不同，分為萊豆根瘤菌肥料、大豆根瘤菌肥料、花生根瘤菌肥料、三葉草根瘤菌肥料、豌豆根瘤菌肥料、首稽根瘤菌肥料、百脈根根瘤菌肥料、紫云英根瘤菌肥料和沙打旺根瘤菌肥料等。

5 技術要求

5.1 菌種

5.1.1 菌種的有效性

用于生產根瘤菌肥料的菌種系屬于根瘤菌屬 (Rhizobium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、固氮根瘤菌(Azorhizobium)、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)等各屬中的不同的根瘤菌種，這些菌種必須是經過鑒定的菌株，或有二年多點田間試驗獲得顯著增產的菌株。該菌種必須在菌肥生產前一年內經無氮營養液盆栽接種試驗鑒定，結瘤固氮性能優良，接種植株干重比對照顯著增加。

5.1.2 菌體特征特性

短桿狀，無芽胞，革蘭氏染色陰性。

5.1.3 菌落形態特征

圓形、邊緣整齊、稍突起，在含有剛果紅的甘露醇 -酵母培養基平板上呈乳白色或無色半透明。

5.2 產品技術指標

5.2.1 液體根瘤菌肥料(見表1)

表 1 液體根瘤菌肥料技術指標

項目
指標
備注

外觀、氣味
乳白色或灰白色均勻渾濁液體，或稍有沉淀。無酸臭氣味


根瘤菌活菌個數， 10 8 /mL
≥5.0


雜菌率， %
≤5


pH值
6.0-7.2
用耐酸菌株生產的菌液， pH值可以大于7.2

寄主結瘤最低稀釋度
10 -6
此項僅在監督部門或仲裁檢驗雙方認為有必要時才檢驗

有效期，月
≥3
此項僅在監督部門或仲裁檢驗雙方認為有必要時才檢驗



5.2.2 固體根瘤菌肥料(見表2)

表 2   固體根瘤菌肥料技術指標

項目
指標
備注

外觀、氣味
粉末狀、松散、濕潤無霉塊，無酸臭味，無霉味


水分含量， %
25-50


根瘤菌活菌個數， 10 8 /mL
≥2.0


雜菌率， %
≤10


pH值
6.0-7.2


吸附劑顆粒細度
大粒種子（大豆、花生、豌豆等）用的菌肥，通過孔徑 0.18mm篩的篩余物≤10%；小粒種子（三葉草、苜蓿、紫云英等）用的菌肥，通過孔徑0.15mm篩的篩余物≤10%

寄主結瘤最低稀釋度
10 -6
此項僅在監督部門或仲裁檢驗雙方認為有必要時才檢驗

有效期，月
≥6
此項僅在監督部門或仲裁檢驗雙方認為有必要時才檢驗



6 抽樣

按每一發酵罐菌液制成的產品為一批，按批抽樣檢驗。抽樣過程要嚴格避免雜菌污染。 6.1 抽樣工具及用品

抽樣前預先準備好無菌塑料袋 (或塑料瓶)、金屬勺、剪刀、封口機(或封口膠帶)、牛皮紙封樣袋、標簽、抽樣封條和膠水。

6.2 抽樣數量及抽樣方法

在成品庫抽樣，按“ ”形分層設點抽樣，抽樣以件為單位，小包裝產品以一包裝箱為一件。大包裝（ 30-50kg ）產品以一袋（或一桶）為一件。抽樣基數由樣品基數的大小確定。 1-10 件，全部抽樣。 11-200 件，抽樣 10 件； 201-400 件，抽取 20 件。樣品基數大于 400 件，按照超過部分的 2% 增加抽樣件數。總件數不超過 40 件。

每件小包裝產品抽取一小袋，在無菌條件下每袋取樣 200g。將所有樣品混勻，按四分法縮到2000g，分裝4袋，然后封口。每2袋為一份裝入牛皮紙封樣袋。最后貼上抽樣標簽和抽樣封條（液體根瘤菌肥小包裝產品抽樣參照此法進行）。所抽樣品一份留存被抽樣單位，一份交檢測中心檢測。

7 檢驗方法

7.1 儀器設備及試劑

7.1.1 儀器設備

生物顯微鏡（ 10×100）；

菌落計數器；

恒溫培養箱；

恒溫干燥箱；

恒溫搖床；

滅菌鍋；

無菌室或超凈工作臺；

酸度計；

溫室或植物光照培養箱：植物葉面光照強度大于 8000lx，溫度控制范圍20-30℃；

試管：ф 15mm×150mm，ф18mm×180mm；

培養皿：直徑 9cm；

三角瓶： 500mL；

無菌吸管： 1、2、5、10mL；

玻璃刮刀；

濾紙；

酒精燈；

標準篩：孔徑 0.18mm和0.15mm；

1號羊毛畫筆；

無菌水；

無離子水。

7.1.2 試劑

7.1.2.1 革蘭氏染色試劑

結晶紫；

番紅；

碘液； 95%酒精。

7.1.2.2 根瘤菌瓊脂培養基

甘露醇（ C 6 H 14 O 6 ） 5g

蔗糖（ C 12 H 22 O 11 ） 5g

酵母粉 0.5g

磷酸氫二鉀（ K 2 HPO 4 ） 0.5g

硫酸鎂（ MgSO 4 ?7H 2 O） 0.2g

氯化納 (NaCl) 0.lg

硫酸鈣 (CaS0 4 ) 0.lg

鉬酸鈉 (Na 2 Mn0 4 ?2 H 2 0) 溶液 lmL

硫酸錳 (MnS0 4 . ? 4H 2 0) 溶液 1ml

檸檬酸鐵 (FeC 6 H 5 0 2 ) l%溶液 1mL

硼酸 (H 3 B0 5 ) l%溶液 1mL

剛果紅 (C 32 H 22 N 6 0 6 S 2 Na 2 ) 1%溶液 2.5mL

瓊脂 18 ~ 20g

水 l000mL

pH值 7.0

7.1.2.3 馬丁培養基(測霉菌數)

磷酸二氫鉀 (KH 2 P0 4 ? 7H 2 0) 0.5g

葡萄糖 (C 6 H 12 0 6 ? H 2 0) l0.0g

硫酸鎂 (MgS0 4 ? 7H 2 0) 0.5g

蛋白胨 5.0g

1%孟加拉紅酒精(無水)溶液 3.3mL

瓊脂 18 ~ 20g

蒸餾水 l000mL

氯霉素 0.lg

7.1.2.4 豆科植物結瘤試驗瓊脂斜面培養基

磷酸二氫鉀 (KH 2 P0 4 ? 7H 2 0) 0.22mg

氯化鉀 (KCl) 155mg

硫酸鎂 (MgS0 4 ? 7H 2 0) 50mg

硫酸鋅 (ZnS0 4 ? 7H 2 0) 0.25mg

硫酸銅 (CuS0 4 ? 5H 2 0) 0.25mg

硼酸 (H 3 B0 5 ) 0.25mg

鉬酸鈉 (Na 2 Mn0 4 ?2 H 2 0) 0.05mg

檸檬酸鐵 (FeC 6 H 5 0 2 ) 30mg

硝酸鈉 (NaN0 3 ) 30mg

瓊脂 5 ~ 10g

水 l000mL

pH 7.0

7.2 成品檢驗

7.2.1 氣味檢驗

取根瘤菌肥料樣品打開包裝，進行感官檢驗。

7.2.2 外觀檢驗

將固體根瘤菌肥料包裝打開，裝在白色搪瓷盤中，將液體根瘤菌肥料搖勻。在明亮光線下進行感官檢驗。

7.2.3 pH值測定

液體根瘤菌肥料的 pH值測定：取供檢菌液直接測定pH值，取三次測定結果的平均數。

固體根瘤菌肥料的 pH值測定：取50mL燒杯一個，加入菌肥25g，無離子水25mL。通過磁力攪拌使溶液均勻后用酸度計測定pH值。取三次測定結果的平均數。

7.2.4 含水量測定

稱取固體根瘤菌肥料三份，每份 20.00g，精確到0.01g，放入已稱恒重的鋁盒中。置105℃干燥箱內烘烤4h，移至干燥器內，冷卻后稱重。根據烘干前后質量差按式(l)計算含水量。取三個樣品測定數的平均值。平行樣品絕對偏差應低于1%。

含水量 (%)=（m 0 -m 1 ）/m 0 ×100 ………………(1)

式中： m 0 一烘干前樣品質量，g

      m 1 一烘干后樣品質量，g。

7.2.5 吸附劑顆粒細度測定

稱樣 10g(精確至0.01g)，置于標準篩中(直徑分別為0.18mm和0.15mm)，用水沖洗，用毛筆輕刷，至粉末不再通過為止。將篩余物置105 ~ 110℃溫度下烘干，稱重。篩余物百分含量按式(2)計算：

篩余物 (%)=篩余物質量/（1-樣品含水量百分數）/樣品質量 ×100 … …… (2)

7.2.6 根瘤菌活菌數及雜菌率的測定

采用平板計數法測定根瘤菌活菌數及雜菌率。

7.2.6.1 制作根瘤菌培養基平板(7.1.2.2)及馬丁培養基平板(7.1.2.3)

7.2.6.2 樣品稀釋培養

稱取 l0g供檢樣品(精確到0.01g)，裝人帶玻璃珠及100mL無菌水的三角瓶中(供檢樣品為液體，則取l0mL加入內裝90mL無菌水的三角瓶中)，置搖床振蕩20min，轉速200r/min。振蕩好的樣品靜置20min后采用10倍稀釋法稀釋至10 -7 (液體樣品稀釋至10 -8 )。從最后三個濃度懸液中各取0.1mL，加至直徑為9cm的培養基平板上，用玻璃刮刀將菌液涂勻。每個稀釋度重復三次。25 ~ 28℃溫度下培養3 ~ 7d。用同樣方法將10 -3 稀釋度菌懸液0.1mL加到馬丁培養基平板上。28℃培養48h。

7.2.6.3 菌落鑒別及計數

根據被檢產品標準描述的菌落特征，鑒別根瘤菌菌落與雜菌菌落。必要時進行革蘭氏染色 (方法見附錄A)、鏡檢，以區分根瘤菌菌落和其他菌落。取菌落30 ~ 300的平板計數。算出三個重復的根瘤菌及雜菌菌落平均數。雜菌是指樣品所含有效活菌(包括根瘤菌及促生細菌)以外的其他種類微生物的總稱。雜菌總數是馬丁培養基上出現的霉菌數與根瘤菌培養基上出現的雜菌數(霉菌除外)之和。

根瘤菌數按式 (3)計算，雜菌率按式(4)計算

根瘤菌數〔億個 /g(mL)〕=菌落平均數×稀釋倍數×基礎液體積/樣品量/加樣量 … (3)

雜菌率 (%)=雜菌總數/（根瘤菌數+雜菌總數）×100 ……… (4)

7.2.7 稀釋結瘤檢驗

寄主植物種子用 0.1%升汞溶液表面消毒后催芽，種芽長1 ~ 2mm時用供試樣品的10 -5 ~ 10 -7 稀釋度的懸液接種，植于試管瓊脂斜面上。設不接種的陰性對照和接種已知菌的陽性對照。重復6次。植物培養溫度20 ~ 25℃，植物葉面光照強度大于8000lx，每天光照12h。10 ~ 20d后觀察結瘤狀況。如空白對照結瘤，試驗需要重做。空白對照不結瘤，正對照結瘤，可以進行判定。在10 -6 稀釋度中70%植株結瘤為稀釋結瘤合格。

7.2.8 有效期的檢驗

在產品說明書標明的有效期到達前 10d測定活菌數，或按產品說明書標明的使用量對寄主進行接種試驗(7.2.7)。活菌數達到標準要求或70%植株結瘤為有效期合格。

8 檢驗規則

8.1 檢驗分類

8.1.1 產品出廠檢驗

產品交貨時進行的檢驗。

8.1.2 產品型式檢驗

新產品鑒定或國家質檢機構質量監督檢驗。

8.2 檢驗項目

型式檢驗的檢驗項目按 5.2.1或5.2.2要求進行。出廠檢驗不檢有效期。

8.3 判定規則

8.3.1 合格產品:

a)   檢驗結果符合 5.2.1(或5.2.2)所規定的技術指標的產品為合格產品；

b)   雜菌率不符合指標，但液體樣品雜菌率不超過 10%，固體樣品雜菌率不超過20%，在10 -6 根瘤菌平板上無霉菌出現，其他各項指標符合，也可判為合格產品；

c) 在 pH值、水分、吸附劑顆粒細度、外觀和氣味等次要檢測項目中，有兩項不符合技術指標，但活菌數及雜菌率符合指標要求，也可判為合格產品。

8.3.2 不合格產品:

a)   根瘤菌活菌數不符合技術指標，判為不合格產品；

b)   液體樣品雜菌率超過 10%，固體樣品雜菌率超過20%，判為不合格品；

c)    在 10 -6 根瘤菌培養基平板上出現霉菌判為不合格產品；

d)   小粒種子用的根瘤菌肥，吸附劑通過孔徑 0.15mm標準篩的篩余物≥30%，判為不合格產品。

8.3.3 含有芽胞桿菌或假單胞桿菌等促生細菌的根瘤菌肥料產品檢測時，芽胞桿菌和假單胞桿菌的判斷按產品企業標準提供的依據進行。

9 包裝、標識、運輸和貯存

9.1 包裝

9.1.1 內包裝

液體肥料小包裝用塑料瓶或玻璃瓶，大包裝用塑料桶。固體肥料用不透明聚乙烯塑料袋包裝。

9.1.2 外包裝

外包裝采用紙箱，紙箱質量應符合 GB/T 6543要求。箱外用尼龍打包帶加固。

9.1.3 每箱(袋)產品中附有產品合格證和使用說明書，在使用說明中標明使用方法、用量及注意事項。

9.2 標識

在包裝箱 (袋)上印有產品名稱、商標、標準編號、肥料登記證號、生產單位、廠址、生產日期、批號和凈重，并印有防曬、防潮、防凍等標記，若有必要還要加印易碎、防倒置等標記。內包裝上有產品名稱、商標、標準編號、肥料登記證號、有效菌含量、生產日期、有效期、產品性能、使用說明書及生產單位、廠址等。

9.2.1 產品名稱

根瘤菌肥料的產品名稱與產品中根瘤菌的名稱應符合。例如：用大豆根瘤菌生產的肥料，其產品名稱為大豆根瘤菌肥料。

9.2.2 產品性能

在產品性能中應標明產品可接種的豆科寄主名稱。

9.3 運輸和貯存

根瘤菌肥料的運輸和貯存按 NY411-2000中9.3和9.4執行。



附錄 A

(標準的附錄)

革蘭氏染色

革蘭氏染色陽性細菌與革蘭氏染色陰性細菌的細胞壁，對結晶紫 -碘復合物的滲透性不同，而形成染色陽性或染色陰性反應。

A1 染劑

A1.1 結晶紫液(赫克爾Hucker氏配方)

甲液：結晶紫 2g

乙醇 (95%) 20mL

乙液：草酸鍍 0.8g

蒸餾水 80mL

甲、乙液相混合，靜置 48h后使用。此染液較穩定，在不透氣的暗色瓶中可儲存數月。A1.2 盧哥(Lugol)氏碘液

碘 (I)片 Ig

碘化鉀 (KI) 2g

蒸餾水 300mL

先用少量 (3 ~ 5mL)蒸館水溶解碘化鉀，再投入碘片，待碘全溶后，加水稀釋。此染液穩定，在不透氣的暗色瓶中可存數月。

A1.3 脫色液(95%的乙醇)

A1.4 復染液(0.5%的番紅水溶液)

取 2.5g番紅，溶于loomL無水酒精中。取番紅酒精溶液20mL，加入80mL蒸餾水，即成0.5%的番紅水溶液。

A2 涂片

A2.1 在無油跡的干凈載片上用蠟筆劃好格，片端注明日期、片號。

A2.2 在載片上的每個格內滴一小滴無菌水或蒸餾水。用接種環挑取少許菌苔，于水滴邊緣輕輕涂幾下。

A2.3 自然風干或微熱促其快干，干后在火焰上通過1 ~ 2次，以固定涂片。

A3 染色步驟

3.1 滴加結晶紫液，覆蓋約1min。

A3.2 用水沖凈結晶紫液。

A3.3 滴加碘液沖去殘水。并覆蓋約1min。

3.4 用水沖去碘液，將片上水甩凈或用濾紙吸干。

3.5 將片傾斜，并襯以白背景，流滴95%酒精液約20 ~ 30s。立即用水沖凈酒精。

3.6 用番紅液染1 ~ 2(或更長)min。

A3.7 用水洗凈番紅，用濾紙吸干表面水或風干，備鏡檢。

A4 觀察結果

用顯微鏡油鏡直接在載玻片上檢查。紅色為革蘭氏染色陰性，藍紫色為革蘭氏染色陽性。

A5 注意事項

A5.1 革蘭氏染色的配方很多，但染色成功與否，很大程度上取決于經驗。在沒有把握時，最好在同一載玻片上，用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為革蘭氏染色陰性和陽性的對照菌。

A5.2 革蘭氏染色操作中，以涂片和脫色兩步最為重要。涂片切不可過于濃厚。對于易于乳化的細菌，將沾有菌苔的接種環在水滴邊緣輕輕涂一二下即可。鏡檢時，以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準。過于密集的細菌，常常呈假陽性。對純細菌的涂片，以95%乙醇脫色易于掌握。乙醇中含有更多的水分，則脫色力加強，易形成假陰性。要盡量減少載玻片上的殘水。只是甩凈或用乙醇沖去殘水，以脫色20s為宜，用濾紙吸凈殘水，可用乙醇脫色近30s。A5.3 用火焰固定時不可過熱，以載玻片不燙手為宜。過熱會使染色反應不正確。實際上對斜面純細菌涂片，風干后不經火焰固定即可染色。

A5.4 建議復染液用0.5%番紅液。其他復染液，如稀釋的石碳酸復紅液等，可根據具體情況選用。

A5.5 由于龍膽紫不是單一成分的染料，與結晶紫不同，按前述配方染色后，常常不易脫色，出現假陽性。遇到這種情況可將染色劑稀釋后使用。試用的龍膽紫稀釋成十分之一的濃度可以使用，但顏色仍然不如結晶紫。

A5.6 對一般容易生長的異養細菌，以檢查培養18 ~ 24h的菌為宜。革蘭氏染色陰性細菌的染色反應穩定，不易受菌齡的影響。革蘭氏染色陽性細菌的染色反應，有的受菌齡的影響：較幼的細胞，培養18 ~ 24h或更短的，呈陽性反應，較老的細胞，培養24h或48h以上的細胞，則部分或全部細胞轉變為陰性反應。區分革蘭氏染色反應時應注意。

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