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玉米種子純度檢驗標準



            中華人民共和國農業行業標準
                            玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法  NY／T 449--2001
                                        Identification purity of maize variety
                                        using salting in protein eletrohporesis
            1范圍
              本標準規定了玉米單交種及親本的真實性和品種純度的室內檢測方法。
              本標準適用于玉米單交種及親本的真實性和品種純度鑒定。
            2引用標準

            下列標準所包含的條文，通過在本標準中引用而構成為本標準的條文。本標準出版時，所示版本均為有效。所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標準最新版本的可能性。
              GB／T 3543.2－1995農作物種子檢驗規程扦樣
              GB／T 3543.5—1995農作物種子檢驗規程真實性和品種純度鑒定
              GB 4404.1－1996糧食作物種子禾谷類
            3定義
              本標準采用下列定義。
            3．1種子真實性
              供檢品種與文件記錄（如標簽等）是否相符。
            3．2品種純度
              品種在特征特性方面典型一致的程度，用本品種的種子數占供檢本作物樣品種子數的百分率表示。
            ［GB／T 3543．5］
            3．3育種家種子
              育種家育成的遺傳性狀穩定的品種或親本種子的最初一批種子，用于進一步繁殖原種的種子。
            4原理
              從玉米種子中提取的鹽溶蛋白在聚丙烯酸胺凝膠的濃縮效應、分子篩效應和電泳分離的電荷效應作用
            下進行分離，通過染色顯示蛋白質譜帶類型。不同玉米品種由于遺傳組成的不同，種子內所含的蛋白質種類有差異，這種差異可利用電泳圖譜加以鑒別，從而對種子真實性和品種純度進行鑒定。
            5儀器設備及試劑
            5．1儀器設備
              電泳儀（500 V士5 V連續可調、0～400 mA連續可調、額定輸出功率200 W）、垂直板夾心式電泳槽、單籽粒粉碎器、天平（感量 0. 01g、0. 001g、0. 0001g各一臺）、酸度計、磁力攪拌器、高速離心機（5 000 r／min以上）、電冰箱、電爐、離心管（ 1. 5   mL）、離心管架、移液管（ 10 mL、5mL、2 mL各兩支）、微量進樣器（ 5～IOO μL）、恒溫箱、觀片燈等。
            5．2試劑

            丙烯酸膠、N，N’一亞甲基雙丙烯酸胺、乳酸、乳酸鈉、甘氨酸、抗壞血酸、硫酸亞鐵、氯化鈉、蔗糖、甲基綠、基綠、三氯乙酸、過氧化氫、考馬斯亮藍R25O、無水乙醇、正丁醇等（所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水）。
            6溶液配制
            6．1電極緩沖液
              稱取甘氨酸 6.00 g，倒入2 000 mL燒杯中，加入 1800 mL去離子水溶解，用 2.0 ml。乳酸調至pH3.3，再加去離子水定客至 2 000 mL，混勻。
            6．2樣品提取液
              稱取氯化鈉 5.80 g，蔗糖200.00 g，甲基綠0.1515 g，倒人 I000 mL燒杯中，加去離子水800 ml。溶解，加熱至微沸，放至室溫，再用去離子水定容至 I000 mL。在 4℃條件下保存。
            6.3分離膠緩沖液
              取1.43 mL乳酸鈉于 I000 mL燒杯中，加去離子水 980 mL，用乳酸調至pH3．0，再加去離子水定容至 IOOO mL，貯于棕色瓶中，在4℃條件下保存。
            6．4分離膠溶液
              稱取丙烯酸胺112.50g，N，N’一亞甲基雙丙烯酷胺3.75g，抗壞血酸0. 25g，硫酸亞鐵8.Omg，用分離膠緩沖液溶解，再用分離膠緩沖液定容至I000mL，過濾于棕色瓶中，在4℃條件下保存（不超過 14天）。
            6．5濃縮膠緩沖液
              取O．3O mL乳酸鈉于2OO mL燒杯中，加去離子水 90 mL，用乳酸調至pH5.2，再加去離子水定客至IOO mL，貯于棕色瓶中，在4℃條件下保存。
            6．6濃縮膠溶液
              稱取丙烯酸胺 6.00 g，N，N’一亞甲基雙丙烯酸胺 1. OO g，抗壞血酸 O.03 g，硫酸亞鐵0.8 mg，用濃縮膠緩沖液溶解，再用濃縮膠緩沖液定容至 IOO mL，過濾于棕色瓶中，在4℃條件下保存（不超過 6天）。
            6．7  3 ％的過氧化氫溶液
              取3O％的過氧化氫 lmL，加 9 mL去離子水，貯于棕色瓶中，在 4℃條件下保存。
            6．8染色液
              稱取考馬斯亮藍R25O 2． OO g，在研缽中用 IOO mL無水乙醇研磨溶解。過濾于棕色瓶中。取 IO mL該溶液，加入到 2OO ml，的 10％（W／V）三氯乙酸溶液中，混勻。
            7電泳操作
            7.1樣品制備
              按 GB／T 3543.2的要求，從送驗樣品中隨機分取玉米種子至少 IOO粒，用單籽粒粉碎器粉碎，放入1.5mL離心管中，用滴管加入與樣品體積相同的樣品提取液，搖勻，放置 5 min后．再搖一次，3O min后，用離心機離心（5 000r／min）15 min，取上清液用于電泳。
            7．2凝膠制備
            7．2．1膠室制備
              將預先洗凈晾干的玻璃板裝人膠條中，然后把膠條固定在垂直板電泳槽內，保持水平，短板向正極，擰緊螺栓，備用。
            7．2．2封底縫
              根據電泳槽大小，取適量分離膠溶液于燒杯中，用微量進樣器加入適量3％的過氧化氫溶液（一般每5 mL分離膠溶液加 2O μL，3％過氧化氫溶液），迅速搖勻，并從長玻璃板外測活玻璃板倒入，振動電泳槽 3次，放平。
           7.2.3灌分離
           膠底縫封住后，用濾紙條插入兩玻璃板之間，吸去團聚合而析出的水；量取分離膠溶液適量，加入3％過氧化氫溶液（～般每 15 mL分離膠溶液加 3％過氧化氫 20μL）迅速搖勻；傾斜電泳槽，將分離膠溶液倒入兩玻璃板之間，高度距短玻璃板上沿 1.2 cm；放平電泳槽并在試驗臺上振動 3次后，迅速加入適量的正丁醇封住膠面。待凝膠聚合后，吸出分離膠表面上的正丁醇，并用去離子水沖洗膠面3次，用濾紙吸干。
            7．2．4灌濃縮膠
              量取濃縮膠溶液適量，加入 3％過氧化氫溶液（一般每 5 mL濃縮膠溶液加 3％過氧化氫溶液40 μL），迅速攪勻，倒入兩玻璃板之間，馬上插好樣品梳，樣品梳底部距分離膠頂部O．5 cm。
            7.2.5點樣
              濃縮膠聚合后，拔出樣品梳并將樣品槽清理干凈，用微量進樣器在每個樣品槽中加入不同籽粒的樣品上清液  15 μL，每點一粒后，都要用去離子水清洗進樣器  3次。
            7．2．6電泳

            加樣完畢后，倒入電極緩沖液，上槽電極緩沖液面要高于短玻璃板，下槽電極緩沖液面要高于鉑金絲；將電源線正極接上槽，負極接下槽；接通電源，采用 SOO V穩壓進行電泳，待甲基綠指示劑下移至膠底部邊緣時，關閉電源。
            7．2．7卸板
              倒出電極液，從電泳槽內取出膠室，卸下膠條，啟開玻璃板，取出膠片，浸人染色液中。
            7．2．8染色
              在 3OC恒溫條件下染色 2～4 h。
            7.2．9洗板
              取出膠片，用O．5％的不加酶洗衣粉水洗凈。
            8結果計算
            8.1電泳測定值計算
              待整個供檢樣品電泳結束后，在觀片燈上鑒定膠片上電泳譜帶的特征和一致性，計數供檢樣品粒數和非本品種粒數，并按式（1）計算電泳測定值足
                                               供檢樣品粒數一非本品種粒數
                                      X（％）＝－－－－－－－－－－－－－×100％   ……………（1）
                                                      供檢樣品粒數
            8．2樣品純度值計算
              將電泳測定值X代入式（2）回歸方程，計算出樣品純度值廣，再將．與GB 44O4．l中的純度值進行比較，判定樣品是否合格。
                                      Y＝52．9＋O．46lX               ……………………………（2）

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